Домой Строительство дома Современные проблемы науки и образования. Способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом "днк-комет" Экспериментальные методы анализа разрывов днк

Современные проблемы науки и образования. Способ обработки и анализа изображений кометоподобных объектов, полученных методом "днк-комет" Экспериментальные методы анализа разрывов днк

Метод гель-электрофореза отдельных клеток или метод ДНК-комет является высокочувствительным и обеспечивает высокую надежность получаемых результатов, в то же время относительно прост и быстро выполним, а также является стандартизованным на международном уровне (OECD № 489). Данный метод является наиболее перспективным для решения следующих задач:

Биомониторинг человека и окружающей среды, то есть выявление последствий индуцированного мутагенеза при контакте человека с ксенобиотиками (лекарственными средствами, пищевыми добавками, пестицидами, парфюмерно-косметическими средствами, бытовой химии, а также наиболее широко распространенными загрязнителями воды, воздуха и производственные вредности, наноматериалы);

Исследование в области онкологии;

Исследования систем репарации ДНК;

Метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле поврежденной ДНК и/или фрагментов ДНК индивидуальных лизированных клеток, заключенных в тонкий агарозный гель на стандартном предметном стекле. При этом ДНК клетки мигрирует, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК. После завершения электрофореза стекла красят и анализируют, используя флуоресцентную микроскопию.

Получение изображения и обработку данных осуществляют с помощью программно-аппаратного комплекса, включающего в себя высокочувствительную камеру, совмещенную с микроскопом, и специализированное программное обеспечение.

Универсальное интеллектуальное программное обеспечение, входящее в данный комплекс, обеспечивает:

Автоматизацию анализа изображений ДНК-комет «одним нажатием клавиши», включает все основные параметры измерения в том числе % ДНК в хвосте кометы;

- высокую воспроизводимость;

Анализ параметров ДНК-комет проводится и в режиме «реального времени» и с сохраненных цифровых изображений;

Программа производит обработку данных и выводит их в виде протокола в соответствии с международными требованиями GLP;

Анализ и сравнение данных;

Программа полностью валидирована и соответствует международными требованиями GLP. Имеет иерархический доступ и систему защиты данных.

В комплект входят:

1. Микроскоп люминесцентный медико-биологиче ский Nikon Eclipse Ni-E.

2. Эпи-флюоресцентная осветительная система мощностью 50W, комплекты фильтр-дихроично е зеркало-фильтр для красителей DAPI, FITC, TRITC.

3. Монохромная CCD IEEE1394 FireWire видеокамера для люминесценции. Basler Scout scA1300-32fm. Размер пиксела - 3.75 µm x 3.75 µm. Разрешение - 1296 px x 966 px. Размер сенсора 1/3 дюйма. Матрица - Sony. Передача данных через высокоскоростной порт - 1394 BUS. Скорость отображения кадров при максимальном разрешении - 32кадра/сек. Обеспечивает работу с объектами в режиме реального времени

4. Comet Assay IV - программный пакет для Windows с генератором электронных таблиц для Microsoft Excel, для работы с монохромной CCD IEEE1394 FireWire видеокамерой в режиме реального времени (змерения и анализ возможно как на видеопотоке так и на фотографиях), инструкция по эксплуатации и компакт диск для инсталляции и валидации программы.

5. Лицензия на срок один год для четырех пользователей.

6. Дистанционное обучение через сеть Internet четырех пользователей.

Дополнительно предлагется:

1. Оператор данных для использования Comet Assay IV в XML версиях баз данных для поиска фильтрации и извлечения данных и аудита через защищенную базу данных Oracle с сохранением в формате MS Excel для работы в электронных таблицах. Включает возможность просмотра авто-сохраненных изображений, подписей, архивных данных и данных авто-аудита. Дополнительно включает в себя возможность экспорта в XML формат неподписанных и подписанных цифровой подписью данных. Включает в себя Крипто-Ключ-Пров одник для просмотра подписанных цифровыми подписями данных в различных форматах.

2. Менеджер доступа к системе GLP. Access Manager это программа для контроля и управления доступом сотрудников к базам данных. Унифицированная для PI генетической токсикологии система. Включает в себя комплексный аудит системы. Внешний аудит. Администрировани е учетных записей пользователей и пользовательской деятельности, связанной программами, доступа, паролей, ревизии и т.д. Использует Oracle, для надежной защиты пользователей и данных аудита. Полное соответствие требованиям FDA 21 CFR Part 11 окончательные правила для электронных записей и электронных подписей.

3. Обучение одного пользователя на базе Perceptive instruments в Великобритании

1

Проведено изучение показателей фрагментации ДНК методом ДНК-комет в щелочной модификации в условиях разного уровня воздействия радиационного фактора в бытовых условиях. Проведен учет объемной активности (ОА) радона, мощности амбиентной эквивалентной дозы (МАЭД) гамма-излучения и плотности потока бета-излучения. Среднее значение ОА радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Средний уровень фрагментации ДНК составил 3,48%. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям (доля ДНК в хвосте кометы, длина хвоста кометы, момент хвоста кометы) был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости. Показатели ДНК-комет не отличались значимо в зависимости от изменения уровня радона. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения. При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

ионизирующее излучение

днк-кометы

щелочная модификация днк-комет

эффекты низких доз облучения

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. The cellular and molecular carcinogenic effects of radon exposure: a review // Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 7, pp. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Assessing the level of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes in long-term resident children under conditions of high exposure to radon and its decay products // Mutagenesis, 2015, vol. 30, pp. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res., 1988, vol. 175, pp. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions // Mutat. Res., 2011, vol. 724, no. 1–2, pp. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. et al. A cross platform public domain PC image analysis program for the comet assay // Mutation Research, 2003, vol. 534, pp. 15-20.

6. Glantz S.A. Primer of Biostatistics / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, 7 edition, 2011. – 320 p.

7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Induction and repair of clustered DNA lesions: what do we know so far? // Radiat. Res., 2013, vol. 180, pp. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Assessment of radiation induced DNA damage in human peripheral blood lymphocytes using COMET assay // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vol. 3, no. 4, pp. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Usage of the standard and modified comet assay in assessment of DNA damage in human lymphocytes after exposure to ionizing radiation // Radiology and Oncology, 2009, vol. 43, no. 2, pp. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. et al. DNA repair gene XPD and XRCC1 polymorphisms and the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Res., 2009, vol. 33. pp. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polymorphisms of DNA repair genes: ADPRT, XRCC1, and XPD and cancer risk in genetic epidemiology // Meth. Mol. Biol., 2009, vol. 471. pp. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. DNA excision repair and double-strand break repair gene polymorphisms and the level of chromosome aberration in children with long-term exposure to radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vol. 92, no. 8, pp. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Lack of adverse effect of smoking habit on DNA strand breakage and base damage, as revealed by the alkaline comet assay // Mutat. Res., 1999, vol. 440, pp. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Seasonal variations as predictive factors of the comet assay parameters: a retrospective study // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Воздействие радона хорошо изучено в диапазоне высоких концентраций. Установленные гигиенические нормативы предусматривают уровень эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) в 200 Бк/м3 как границу допустимой объемной активности радона в воздухе жилых помещений. В то же время в ряде стран допустимый уровень увеличен до 400 Бк/м3, что объясняется, прежде всего, геологическими особенностями территории. С другой стороны, существует точка зрения о необходимости снижения допустимого уровня до 2 пКю/л, что соответствует 74 Бк/м3. В рамках современной парадигмы ВОЗ и принципа линейного беспорогового увеличения радиационных эффектов даже небольшое радиационное воздействие приводит к увеличению риска возникновения стохастических эффектов (прежде всего онкозаболеваний).

Очевидно, что небольшие радиационные эффекты, воздействующие на большие группы людей, могут приводить к социально значимому увеличению частоты онкологической заболеваемости . Вследствие этого представляется крайне актуальным накопление информации об эффектах действия различных типов ионизирующего излучения в малых дозах, которому подвержено в той или иной степени все население планеты. Увеличение ЭРОА радона выше 200 Бк/м3 признается нежелательным для большинства принятых нормативов в области радиационной гигиены. В то же время лишь 5-10% жилых помещений можно отнести к помещениям с таким уровнем воздействия. Уровень объемной активности (ОА) радона в 2 пКю/л (74 Бк/м3) и выше может отмечаться в 20-50% жилых помещений в зависимости от типа застройки и географического расположения. Очевидно, что даже малоинтенсивное воздействие радона может приводить к значимому увеличению заболеваемости, учитывая глобальные масштабы проблемы. Представляется актуальным исследование влияния низкодозовых нагрузок плотноионизирующего излучения на организм человека.

Радон признается в настоящее время одним из наиболее опасных канцерогенов, действующих на человека. В природе радиационный радоновый фактор не играет существенной роли, поскольку газ радон рассеивается в большом объеме воздуха и достаточно быстро распадается (период полураспад Rn222=3,82 суток). В то же время жилые и технические постройки представляют собой своеобразные ловушки, накапливающие радон (до 10 крат в сравнении с открытым воздухом). Очаги выделения радона часто располагаются спорадически, радон рассматривается в качестве ведущей причины повышения частоты хромосомных аберраций в схожих экспонированных группах .

Одним из эффективных методов биомониторинга является прямая оценка степени повреждения ДНК в клетках крови методом «ДНК-комет» (гель-электрофорез отдельных клеток). Данный метод предусматривает лизис клеток, помещенных в агарозный гель, при этом ДНК мигрирует в электрическом поле. Клетки с увеличенной частотой двойных разрывов характеризуются увеличением миграции ДНК к аноду. В 1988 году в работе Singh и коллег была предложена щелочная модификация метода, включающая этап лизиса при рН>13 . Данная версия значительно повышает чувствительность метода, позволяя выявлять одиночные разрывы, щелочелабильные сайты, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, а также сайты незавершенной репарации . Поскольку для большинства генотоксикантов преобладают эффекты одиночных разрывов ДНК, щелочная модификация метода позволила существенно увеличить информативность и чувствительность теста. Одно из главных преимуществ - возможность выявить генотоксическое воздействие в условиях одновременного действия цитотоксических факторов, которые приводят к формированию хромосомных нарушений, но не обладают генотоксическим действием. В условиях рН>12 ДНК денатурирует, и нити расплетаются вследствие разрушения водородных связей между 2 спиралями. При достижении рН 12,6 щелочелабильные сайты, например апуриновые/апиримидиновые сайты, трансформируются в одиночные разрывы ДНК. При рН>13 достигается максимальная степень трансформации щелочелабильных сайтов.

Материалы и методы

Характеристика выборки

Каждый обследованный заполнял персональную анкету, включавшую информацию о возрасте, состоянии здоровья, употреблении табака и алкоголя, производственных вредностях, рентгенодиагностических процедурах, авиаперелетах, прививках и приемах лекарственных препаратов в течение 3 месяцев, предшествующих обследованию. Была отобрана группа из 39 обследованных, не подвергавшихся потенциально генотоксическим факторам. Все обследованные были не старше 40 лет. Всего было обследовано 18 мужчин (средний возраст 29 лет) и 21 женщина (средний возраст 31 год).

Исследование проводили в соответствии с требованиями Комиссии по этике Кемеровского государственного университета, протокол исследования утвержден на заседании Комиссии № 4 от 10.10.2016 г. Каждый участник подписывал форму информированного согласия, содержащую информацию о целях исследования.

Образцы биоматериала

Образцы венозной крови собирались в вакуумные пробирки емкостью 4 мл, содержащие натрий-ЭДТА в качестве антикоагулянта. Сбор материала происходил в период с ноября 2016 г. по апрель 2017 г. В течение 1-2 часов образцы переправлялись лабораторию. Все образцы кодировались и обрабатывались. Выполнение метода «ДНК-комет» начиналось немедленно после поступления образцов.

Гель-электрофорез отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)

Метод «ДНК-комет» выполнялся в щелочной модификации, разработанной Singh с коллегами . Первый слой геля представлял собой 1% раствор стандартной агарозы (Applichem, США). Для нанесения клеток использовали 1% агарозу с низкой температурой плавления (low melting point agarose, Applichem, США) при 39 °С. 70 мкл взвеси клеток крови в легкоплавкой агарозе вносили на стекло со стандартной агарозой и помещали на лед до полного застывания геля. После застывания стекла помещали в лизирующий буфер при температуре 4 °С на 12 часов. Состав лизирующего буфера: 2,5 моль/л NaCl («Вектон», Россия), 0,1 моль/л Nа2ЭДТА («Вектон», Россия), 1% Тriton Х-100 (Amresco, США), 10% ДМSO («Вектон», Россия). После лизиса проводился горизонтальный электрофорез (300 мА, 25 В, 30 мин.) в щелочном буфере (pH>13). Электрофорезу предшествовала 20-мин. обработка щелочным буфером (300 мМ NaOH («Вектон», Россия), 1 мМ Nа2ЭДТА («Вектон», Россия). Лизис и электрофорез проводился при 4 °С при отсутствии прямых солнечных лучей. После электрофореза стекла троекратно нейтрализовали в фосфатно-солевом буфере PBS рН 7,5 (Amresco, США). После этого стекла обрабатывались 70% этанолом в течение 5 минут. Препараты высушивались и окрашивались 50 мкл однократного SYBR GREEN («Биотех-Индустрия», Россия).

Анализ «комет»

Оценка параметров фрагментации проводилась путем микрофотографирования препаратов, окрашенных SYBR GREEN, с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager 2. Всего фотографировалось 100 случайно отобранных комет от каждого исследованного образца при увеличении х400. Последующая обработка фотографий проведена с помощью комплекта ПО CASP . Рассчитывались параметры длины хвоста кометы, момента хвоста, а также доля ДНК в хвосте кометы.

Статистические методы

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Для количественных показателей рассчитывались средние значения и пределы 95% доверительного интервала (CI 95). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна-Уитни. Степень значимости была принята на уровне 5%. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов. При этом для выборок более 50 человек также рассчитывали значение критерия Стьюдента, основанное на значении коэффициента корреляции Пирсона .

Результаты

Доля ДНК в хвосте кометы не превышала 15%. Среднее значение объемной активности (ОА) радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости (табл. 1).

Таблица 1

Показатели фрагментации ДНК у обследованных мужчин и женщин

В качестве граничного уровня ОА радона в воздухе был выбран уровень 74 Бк/м3, соответствующий 2 пКю/л воздуха. Средняя ОА радона составила 47 Бк/м3 в первой группе и 143 Бк/м3 во второй группе. Наибольшая информативность была установлена для показателя момента хвоста комет. Момент хвоста был повышен в группе с более высоким уровнем радона, но эта тенденция не достигла уровня статистической достоверности (табл. 2). Данная тенденция характерна только для обследованных мужчин.

Таблица 2

Показатели фрагментации ДНК в группах, дифференцированных по полу и ОА радона

ОА радона в воздухе помещений, Бк/м3

% ДНК в хвосте кометы

Длина хвоста, мкм

Момент хвоста кометы

3,65

13,73

0,94

3,97

14,52

1,43

3,30

13,21

0,88

3,00

11,95

0,72

3,43

13,42

0,90

3,51

13,30

1,09

Также была исследована возможная зависимость показателей ДНК от величины МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях. Для проверки был рассчитан коэффициент корреляции между показателями повреждений ДНК и МАЭД гамма-излучения. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения (рисунок). При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

Зависимость показателей фрагментации ДНК от МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях (r - коэффициент корреляции Спирмена, p - вероятность «нулевой» гипотезы)

Обсуждение

Радиационное воздействие

Ионизирующее излучение способно индуцировать образование кластеров повреждения ДНК, что реализуется в форме двухцепочечных разрывов и другими повреждениями, расположенными компактно. Редко- и плотноионизирующее излучение вызывает примерно одинаковое количество отдельных ДНК-поражений на единицу поглощенной дозы, но в случае с плотноионизирующим излучением (альфа-частицы) эти поражения распределены в меньшем количестве участков ДНК, что подразумевает увеличение числа повреждений в кластере; например, среднее число повреждений по кластеру, как правило, увеличивается с увеличением линейной передачи энергии . Гамма-излучение, зафиксированное в местах проживания всех обследованных, не превышает регламентированных фоновых значений. Изменения гамма-фона, скорее всего, были вызваны особенностями строений и строительными материалами.

Анализ «комет»

Метод «ДНК-комет» представляет простой и быстрый тест, позволяющий эффективно измерять уровень повреждений ДНК и репарации повреждений, следующей после экспонирования. В данном исследовании не было обнаружено значительной гетерогенности в отношении уровня повреждения ДНК в исследованной популяции. В ряде работ, посвященных биологической дозиметрии, ранее отмечались трудности выявления эффекта малых доз облучения . В то же время в большинстве работ исследовались группы лиц, облученных внешним искусственным источником, например персонал радиологических и рентгенологических установок.

Измерения показателей фрагментации ДНК могут отражать как индивидуальный уровень повреждений ДНК, так и способность к репарации радиационных повреждений. Ранее в ряде работ установлена способность генов репарации модулировать частоту нарушений наследственного материала . Наблюдаемая картина повреждений ДНК является результатом равновесия между нарушениями и репарацией ДНК, и низкий уровень повреждений или отсутствие выраженных корреляций может быть результатом как низкого числа повреждений, так и высокой индивидуальной эффективности репарации .

По некоторым оценкам, наибольший вклад в увеличение показателей ДНК комет для непроизводственных факторов вносят сезон года (параметры увеличены летом) и медицинское облучение . В нашей работе эти факторы не могут оказывать значимого влияния, поскольку сбор биологического материала проводился в зимний период года, а все лица, проходившие рентгеновские обследования в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию, были исключены из выборки. Отсутствие корреляций с объемной концентрацией радона, возможно, объясняется небольшим размером выборки. В дальнейшем планируется продолжение данной линии исследования с увеличением размера выборки.

Заключение

Исследование эффектов длительного воздействия малых доз облучения представляется сложной задачей, необходимость подбора выборок и контроля сопутствующих факторов способна исказить картину. В представленном исследовании не удалось выявить статистически значимых корреляций с показателями объемной активности радона, но в то же время обнаруженные корреляции с показателями гамма-фона указывают на перспективы данного исследования. Очевидна необходимость оценки фактора эффективности репарации обследованных для исследования такого типа, это позволило бы провести дифференцировку и сравнить людей с близкими характеристиками репарации.

Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (№ 16-34-60069\15 мол_а_дк).

Библиографическая ссылка

Ларионов А.В., Волобаев В.П., Сердюкова Е.С. ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДНК-КОМЕТ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ ЖИЛЫХ ПОМЕЩЕНИЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (дата обращения: 01.02.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

Оценка генотоксических свойств
методом ДНК-комет
in vitro

MP 4.2.0014-10

Москва 2011

1. Разработаны: НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва (чл.-корр. РАМН, профессор, д.м.н., А.Д. Дурнев, к.б.н. А.К. Жанатаев); Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН , Пущино, Московская область (Н.П. Сирота); Открытое Акционерное Общество Завод экологической техники и экопитания «ДИОД», Москва (академик РАЕН, к.т.н. В.П. Тихонов, к.б.н. Т.В. Шевченко, к.б.н. И.А. Родина, К.Л. Плигина).

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 14 октября 2010 г.

3. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro

MP 4.2.0014-10

Введение

Предупреждение контакта человека с потенциальными генотоксикантами представляется наиболее конструктивным способом защиты организма человека от последствий индуцированного мутагенеза. Вместе с тем, тотальная проверка ксенобиотиков/комплекса ксенобиотиков на генотоксичность невозможна вследствие огромного объема исследований. Это обусловило внедрение в практику генотоксикологических исследований понятия «первоочередность» тестирования. Первоочередному тестированию подлежат лекарственные средства, пищевые добавки, пестициды, парфюмерно-косметические средства, бытовая химия, а также наиболее широко распространенные загрязнители воды, воздуха и производственные вредности. Для удешевления и ускорения работ по генетическому скринингу проводится изучение генотоксичности с помощью простых и быстровыполнимых методов и использованием качестве тест-объекта микроорганизмов или культур клеток млекопитающих.

Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод гель-электрофореза отдельных клеток или метод ДНК-комет. Метод является высокочувствительным и обеспечивает высокую надежность получаемых результатов.

Данные методические рекомендации содержат порядок проведения оценки генотоксических свойств с применением метода ДНК-комет в клетках млекопитающих в системе in vitro . Преимуществом настоящей тест-системы являются простота, экономичность, быстрота получения результатов. Кроме того, система отвечает современным этическим требованиям, согласно которым следует ограничивать использование млекопитающих в эксперименте.

1. Область применения

Методические рекомендации предназначены для токсикологических (генотоксикологических) исследований и испытаний пищевых ингредиентов (пищевых добавок, красителей и др.), биологически активных добавок к пище и сырья для их производства, парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта, товаров бытовой химии, полимерных материалов и различных изделий из них (изделия детского ассортимента, изделия, контактирующие с пищевыми продуктами), сырья и продуктов, с том числе полученных с применением нанотехнологий, а также объектов и факторов среды обитания (вода централизованных источников, сточная вода и т.д.).

2. Принцип метода

Метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле поврежденной ДНК и/или фрагментов ДНК индивидуальных лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК.

Общая процедура метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию, окрашивание и микроскопический анализ. Гель-слайды готовятся с использованием предметных стекол, которые покрывают агарозным гелем. Исследуемые образцы инкубируют с клетками, затем в агарозном геле на подготовленные гель-слайды. После затвердевания геля клетки подвергают лизису, приводящему к разрушению клеточных и ядерных мембран, диссоциации ДНК-белковых комплексов. Проводится щелочная денатурации (рН > 13), которая переводит щелочно-лабильные сайты ДНК в однонитевые разрывы, затем проводят электрофореза. После завершения щелочного электрофореза слайды нейтрализуют, окрашивают и анализируют под флуоресцентным микроскопом. Далее проводят компьютерный анализ цифровых изображений комет с помощью специализированного программного обеспечения и определяют основной показатель процент ДНК в хвосте кометы и другие параметры.

3. Оборудование, материалы и реактивы

Ламинарный бокс с вертикальным потоком

Микроскоп эпифлуоресцентный

Высокочувствительная цифровая фотокамера или видеокамера с адаптером к микроскопу

Микроскоп инвертированный

СО 2 -Инкубатор встряхиватель лабораторный типа Вортекс

ТУ 64-1-1081-73

рН-метр или аналоги

ТУ-4215-00-18294344-01

Термометр лабораторный 0 - 55 °С

Холодильник бытовой

Микротермостат для пробирок 25 - 99 °С

Камера для горизонтального электрофореза

Источник питания для электрофореза (диапазон регулирования напряжения до 400 В)

Центрифуга лабораторная

Центрифуга лабораторная для микропробирок

Магнитная мешалка

ТУ 25-11-834-73

Весы аналитические (предел допустимой погрешности не более 0,01 мг)

Плитка электрическая

Колбы, цилиндры стеклянные мерные

Колбы стеклянные лабораторные вместимостью 0,5 и 1,0 дм 3

Микропробирки пропиленовые конические объемом 0,5 и 1,5 см 3 с крышкой

Штатив для микропробирок вместимостью 0,5 и 1,5 см 3

Наконечники одноразовые для дозаторов переменного объема в штативах

Дозаторы автоматические переменного объема

ТУ 9452-002-33189998-2002

Часы сигнальные

ТУ 25-07-57

Пинцеты медицинские

Шпатели металлические

Камера для счета форменных элементов крови по Горяеву

ТУ 42-816

Стекла покровные для микропрепаратов

Стекла предметные

Спиртовка лабораторная стеклянная

Фильтры АФА-ВП-10

ТУ 95-743-80

Фильтровальная бумага

Агароза универсальная Тип I

Агароза легкоплавкая (низкоплавкая) Тип VII

Вода дистиллированная

Натрия гидроокись

Этилендиамин-N,N,N ¢ ,N ¢ -тетрауксусной кислоты динатриевая соль двухводная

N-лауроилсаркозин натриевая соль

Натрий хлористый

Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный

Калий фосфорно-кислый однозамещенный

Калий хлористый

Трис (гидроксиметил)-аминометан

ТУ 6-09-4292-76

Тритон Х-100

Этидий бромистый

ТУ 6-09-13-452-75

Краситель SYBR Green 1 (возможно использование других красителей, применяемых для визуализации ДНК:DAPI; пропидиум иодид, акридиновый оранжевый и др.)

Эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота

Среда ДМЕМ;

Среда RPMI-1640

Смесь Ficoll-Paque или аналогичная

L-глутамин

Пенициллин

Стрептомицин

3.1. Характеристика объектов исследования

Для оценки генотоксических свойств в качестве тест-объекта используют традиционно применяемые в генотоксикологических исследованиях клетки первичных и перевиваемых клеточных культур человека (лимфоциты периферической крови и фибробласты человека, карцинома шейки матки HeLa, карцинома легкого А-549, карцинома гортани Нер2 и др.). Среди данных тест-объектов целесообразно использовать лимфоциты периферической крови, клеточные культуры фибробластов человека или HeLa, что обусловлено рядом их преимуществ по сравнению с другими клетками: простота процедуры получения материала; высокая синхронизированность популяции клеток, широкая изученность биологических процессов.

4. Культивирование перевиваемых культур клеток

Фибробласты и клетки HeLa культивируют в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (37 °С, 5 % СO 2 ) в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см 2 (посевная концентрация 1 ´ 10 6 клеток/флакон).

5. Подготовка к исследованию

5.1. Подготовка растворов и буферов

Фосфатно -солевой буфер (ФСБ ) рН 7 ,4 (хранят при 4 ° C ).

Фосфатно -солевой буфер с 1мМ ЭДТА - Na (ФСБ + ЭДТА ) рН 7 ,4 (хранят при 4 °С ).

Универсальная 1 % агароза . Готовят 10 мл 1 % раствора универсальной агарозы в ФСБ + ЭДТА в стеклянном флаконе с крышкой на водяной бане до получения полностью прозрачного геля.

Легкоплавкая 1 % агароза . Готовят 1 % раствор легкоплавкой агарозы в ФСБ + ЭДТА и инкубируют в микротермостате при 70 °С до получения полностью прозрачного агарозного геля. Приготовленный агарозный гель охлаждают до (39 ± 2) °С.

Легкоплавкая 0 ,5 % агароза .

Основной лизирующий раствор . Готовят основной лизирующий раствор - 10мМ Трис-HCl (рН 10) 2,5М NaCl, 100 мМ ЭДТА-Na. Раствор хранится при комнатной температуре в течение месяца.

Рабочий лизирующий раствор готовится и используется непосредственно в день эксперимента.

Готовят 1 % раствор Тритон -Х100 в основном лизирующем растворе .

Щелочной раствор для электрофореза (рН13 ). Готовят раствор 0,3M NaOH и 1мМ ЭДТА-Na. Раствор охлаждают до 4 °С.

Раствор этидиум бромида . Готовят раствор с концентрацией этидиум бромида 2 мкг/см 3 в ФСБ. Полученный раствор хранят при 4 °С.

SYBR Green I . Готовят раствор SYBR Green I 1:10000 в ТЕ-буфере. Полученный раствор хранят при 4 °С не более 2 недель.

6. Подготовка объектов исследования

6.1. Подготовка перевиваемых клеток

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывают ФСБ без Са 2+ и Mg 2+ и заливают на 5 минут 0,05 % раствором трипсина (1 см 3 на флакон). Затем инактивируют трипсин средой для культивирования клеток, осторожно пипетируют клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждают центрифугированием (5 мин 400 g). После этого клетки еще 2 раза отмывают в охлажденном растворе ФСБ + ЭДТА (4 °С).

Жизнеспособность клеток оценивают окраской 0,4 % трипанового синего. Суспензию клеток разводят до концентрации 1 ´ 10 6 кл/см 3 (подсчет клеток осуществляют в камере Горяева). До получения микропрепаратов возможно хранение клеток при 4 °С не более 3 часов.

6.2. Получение лимфоцитов периферической крови

Для исследования кровь берут у здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет, не работающих в сфере химического производства, не контактирующих с источниками ионизирующего излучения, не болевших за последние 3 - 6 месяцев вирусными заболеваниями и не проходивших за последние 6 месяцев рентгенодиагностическое обследование. Из локтевой вены асептически отбирают аликвоту крови и переносят в стерильные пробирки, содержащие содержащих антикоагулянт. Цельную кровь смешивают с равным объемом среды RPMI-1640 (без L-глютамина) и осторожно наслаивают на градиентную смесь фиколла Ficoll- Paque (или аналогичную) плотностью 1,077 и центрифугируют при 400 g в течение 40 мин. Образующее на разделе фаз «кольцо» из мононуклеаров аккуратно отбирают пипеткой и дважды отмывают средой RPMI-1 640 центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. После второй отмывки осадок разводят в среде RPMI-1640 до концентрации клеток 1 - 5 ´ 10 5 /см 3 и помещают до использования в холодильник при 4 °С.

6.3. Подготовка исследуемых образцов

6.3.1. Растворители

При работе с гидрофильными веществами в качестве растворителя используют бидистиллированную воду. При работе с гидрофобными веществами в качестве растворителя используют диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации не более 1 %. При необходимости допускается использование других растворителей в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта, что должно быть установлено экспериментально.

6.3.2. Контроли

В качестве негативного контроля используется растворитель, вносимый в эквивалентных объемах. В качестве позитивного контроля используют пероксид водорода. Непосредственно перед использованием готовят 1 мМ раствор пероксида водорода в охлажденном (4 °С) ФСБ.

6.3.3. Исследуемые концентрации

Во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов образцы исследуются в концентрациях, не вызывающих изменение рН инкубационной среды и/или осмотического давления.

Исследование начинают с определения цитотоксичности in vitro . В качестве максимальной исследуемой концентрации принимается 1/2 LC 50 . Если 1/2 LС 50 превышает 10 мМ, то в качестве максимальной концентрации принимается последняя. Для низкотоксичных и нетоксичных образцов в качестве максимальной используется концентрация 5 мг/см 3 , 5 мкл/см 3 либо 10 мМ. Две последующие концентрации для исследования составляют 1 / 10 и 1 / 100 от максимальной.

6.3.4. Подготовка парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта

Экстракты из испытуемых образцов готовят согласно MP № 29 ФЦ/394 от 29.01.03 путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды) приведены в табл. . Навески образцов взвешивают в сухой чистой колбе, куда потом добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при 37 °С. После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры.

Таблица 1

Условия приготовления экстрактов

Масса образца, г

Объем модельной среды, мл

Степень разведения образца

Продолжительность экстракции, час

Шампуни для волос и тела

Жидкое туалетное мыло

Пена для ванн, гель для душа

Дезодоранты и депилятории в аэрозольной упаковке

Туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны

Зубные пасты и отбеливающие системы

После завершения экстракции раствор подвергают фильтрации через бумажный фильтр. Фильтрованию также подвергают модельную среду. Используют фильтр АФА-ВП-10 диаметром 9 см. Бумажные фильтры заранее промывают в дистиллированной воде. Для этого 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 л дистиллированной воды. Стакан накрывают и ставят в термостат на 24 ч при 37 °С. Затем воду сливают и высушивают фильтры, не вынимая: из стакана, в термостате до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

6.3.5. Подготовка товаров бытовой химии

Растворы образцов готовят согласно MP № 29 ФЦ/4746 от 27.12.01. Испытуемый образец в количестве 0,1 г помещают в мерную колбу с притертой крышкой, объемом 250 см 3 , и доводится до метки дистиллированной водой, что соответствует разведению образца 1:2500. Это разведение является стандартным для исследования моющих средств. Во вторую колбу в качестве контроля помещается 250 см 3 дистиллированной воды. Обе колбы помещают в термостат на 24 ч при 37 °С, затем охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения контрольный и опытный образцы подвергают фильтрованию через бумажный фильтр.

6.3.6. Подготовка изделий из полимерных материалов

Образцы изделий из полимерных материалов готовятся согласно МУ № 1.1.037-95 от 20.12.95.

Изделия из полимерных материалов измельчаются на куски максимальным сечением 20 ´ 20 мм. Навеску 30 г помещают в термостойкую колбу, емкостью 250 см 3 , заливают 100 см 3 кипящей дистиллированной воды. По достижении температуры вытяжки 37 °С колбу помещают в термостат и выдерживают до 24 часов при температуре 37 °С.

6.3.7. Подготовка стекол для микропрепаратов

Обезжиренные предметные стекла выкладывают на термостатируемую поверхность электрической плитки, нагретой до 65 - 70 ° С. Расправленную 1 % агарозу из расчета 20 мм 3 на площадь стекла 25 мм 2 , дозатором наносят на край стекла и равномерно распределяют по всей поверхности. После полного высыхания геля стекла снимают и охлаждают до комнатной температуры. Приготовленные стекла для микропрепаратов могут храниться 1 месяц при комнатной температуре.

7. Процедура тестирования

7.1. Инкубация клеток с исследуемыми образцами

В микропробирки, содержащие 5 мм 3 ФСБ, вносят 20 мм 3 раствора исследуемого образца и 225 мм 3 клеточной суспензии (1 ´ 10 6 клеток/см 3). Для контроля растворителя в микропробирки приливают 5 мм 3 ФСБ, 20 мм 3 растворителя и 225 мм 3 клеточной суспензии (1 ´ 10 6 клеток/см 3). Клеточную суспензию с образцами инкубируют при 37 °С в течение 30 мин и 3 ч. По окончании инкубации пробирки центрифугируют при 400 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и осажденные клетки дважды отмывают в ФСБ + ЭДТА центрифугированием при 400 g 5 мин. После второй отмывки осажденные клетки разводят ФСБ + ЭДТА и сразу приступают к процедуре получения микропрепаратов. Каждая экспериментальная точка проводится не менее чем в двух повторностях, по три микропрепарата на каждую повторность.

В микропробирки вносят 25 мм 3 раствора пероксида водорода и добавляют 225 мм 3 клеточной суспензии (1 ´ 10 6 клеток/мл) и инкубируют 5 мин при 4 °С. По окончании инкубации пробирки центрифугируют при 400 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и осажденные клетки дважды отмывают в ФСБ + ЭДТА центрифугированием при 400 g 5 мин. После второй отмывки осажденные клетки разводят ФСБ + ЭДТА и сразу приступают к процедуре получения микропрепаратов.

7.2. Приготовление микропрепаратов

При использовании предметных стекол нестандартного размера для получения микропрепаратов исследуемые клетки иммобилизируют в трехслойные агарозные блоки по принципу «сэндвича». На стекла с высушенной универсальной 1 % агарозой наносят слой универсальной 1 % агарозы. Охлаждают 5 мин 4 °С для застывания геля. В микропробирке быстро смешивают в равных частях (1:1) 1 % легкоплавкую агарозу с суспензией клеток после воздействия исследуемых образцов и наносят следующим слоем. Охлаждают 5 мин при 4 °С для застывания геля. После этого наносят третий слой - 0,5 % легкоплавкую агарозу и охлаждают 5 мин при 4 °С.

При использовании стандартных стекол в микроцентрифужные пробирки с 240 мм 3 агарозного геля вносят 60 мм 3 клеточной суспензии 2 - 3 раза прокачивают дозатором. В центральную часть предметного стекла наносят 60 мм 3 полученного агарозного геля с клетками и накрывают покровным стеклом под углом, так, чтобы не было пузырей. Предметные стекла кладут на поверхность емкости со льдом и оставляют на 10 мин для затвердевания геля. Аккуратно снимают покровные стекла (тянут за край) и предметные стекла помещают в стеклянную кювету.

7.3. Лизис

В кювету с микропрепаратами заливают рабочий лизирующий раствор пока раствор не покроет микропрепараты на 2 - 3 мм, накрывают крышкой и инкубируют при 4 °С в течение 1 ч. Допускается нахождение препаратов в лизирующем растворе до 24 ч.

7.4. Щелочная денатурация

По окончании лизиса, микропрепараты вынимают из лизирующего раствора и переносят в кювету с охлажденным (4 °С) щелочным раствором для электрофореза (рН 13). Инкубируют при 4 °С в течение 20 мин.

7.5. Щелочной электрофорез

Микропрепараты раскладывают на поверхности камеры для горизонтального электрофореза. Электрофорез осуществляют в свежей порции охлажденного (4 °С) щелочного раствора для электрофореза (рН 13) при температуре окружающей среды 20 - 25 °С. Отклонения в указанных температурных режимах может приводить к вариабельности получаемых результатов. Электрофорез проводят в течение 20 мин при напряженности электрического поля 1 В на 1 см длины площадки для микропрепаратов.

7.6. Окрашивание

Микропрепараты помещают в кювету и заливают бидистиллированной водой. Проводят нейтрализацию в течение 5 мин при комнатной температуре. Процедуру нейтрализации повторяют дважды в свежей порции Н 2 O. При окраске препаратов красителем SYBR Green I препараты после электрофореза фиксируются в 70 % растворе этанола в течение 15 мин и высушиваются при комнатной температуре.

Для окрашивания «ДНК-комет» этидиум бромидом микропрепараты погружают в кювету с раствором красителя и инкубируют в темном месте при 4 °С не менее 1 ч. Непосредственно перед проведением анализа микропрепарат, выбранный для регистрации «ДНК-комет», промывают в дистиллированной воде 2 - 3 раза.

Для окраски ДНК-комет SYBR Green I краситель наносят на микропрепарат из расчета 100 мм 3 на площадь 25 мм 2 и проводят окраску в течение 20 мин. По окончании окраски остающийся на микропрепаратах краситель не удаляется.

7.7. Микроскопический анализ

Микропрепараты анализируют под флуоресцентным микроскопом. Рекомендуемое увеличение х200 - х400. С каждого микропрепарата рандомизированно анализируется не менее 50 ДНК-комет без наложений хвостов. Получение изображения и обработку данных осуществляют с помощью программно-аппаратного комплекса, включающего в себя высокочувствительную камеру или цифровой фотоаппарат, совмещенные с микроскопом, и специализированное программное обеспечение. В зависимости от имеющегося программного обеспечения анализ параметров ДНК-комет проводится в режиме «реального времени» либо с сохраненных цифровых изображений. В качестве показателя поврежденности ДНК используют % ДНК в хвосте кометы.

8. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка экспериментальных данных проводится по всем повторностям каждой экспериментальной точки путем сравнения показателей поврежденности ДНК в опытной и контрольной группах с использованием непараметрического критерия Даннета. Данные двух повторностей объединяются и определяется среднее, если 95 % доверительные интервалы перекрываются. Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК или статистически достоверный, воспроизводимый эффект по крайней мере для одной экспериментальной точки. Позитивный результат в данном тесте указывает на то, что исследуемое соединение индуцирует ДНК-повреждения в данном типе клеток в условиях in vitro .

9. Форма представления результатов

Протокол представления результатов:

Название эксперимента ____________________________________________________

Тест-объект (название) ____________________________________________________

Вещество (название) ______________________________________________________

Формула, физико-химические свойства ______________________________________

Откуда получено _________________________________________________________

Растворитель _____________________________________________________________

Позитивный контроль _____________________________________________________

Анализ данных литературы _________________________________________________

Схема эксперимента ______________________________________________________

Дата проведения эксперимента _____________________________________________

Дозы ____________________________________________________________________

Полученные результаты ___________________________________________________

Исполнители _____________________________________________________________

Дата сдачи отчета _________________________________________________________

10. Интерпретация результатов

Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК или статистически достоверный, воспроизводимый эффект по крайней мере для одной экспериментальной точки. Позитивный результат в данном тесте указывает на то, что исследуемый агент индуцирует ДНК-повреждения в данном типе клеток в условиях in vitro .

Показателем генотоксического действия является индекс повреждения (ИП), который вычисляется по формуле:

ИП = «% ДНК в хвосте» в опытной группе/«% ДНК в хвосте» в контрольной группе.

Индекс повреждения, превышающий 2,0, указывает на то, что исследуемый образец обладает генотоксическими свойствами в условиях in vitro .

В случае выявления положительного результата для оценки безопасности применения необходимо проведение дальнейших исследований в тестах in vivo на млекопитающих.

11. Список литературы

1. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Сиднева Е.С., Никитина В.А., Оганесянц Л.А., Середенин С.Б., Бекиш В.Я., Чернуха И.М. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. Москва, 2006, 28 стр.

2. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Оганесянц Л.А. Метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») в пищевой генотоксикологии // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 1. С . 31 - 33.

3. Collins AR, Oscoz AA, Brunborg G, Gaivao I, Giovannelli L, Kruszewski M, Smith CC, Stetina R. The comet assay: topical issues //Mutagenesis. 2008 May; 23(3) : 143 - 51.

4. Comet Assay in Toxicology // A. Dhawan, D. Anderson (Eds); Royal Society of Chemistry, 2009, 461 p.

5. Dhawan A, Bajpayee M, Parmar D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models // Cell Biol Toxicol. 2009 Feb; 25(1): 5 - 32.

6. Landsiedel R, Kapp MD, Schulz M, Wiench K, Oesch F. Genotoxicity investigations on nanomaterials: methods, preparation and characterization of test material, potential artifacts and limitations-many questions, some answers // Mutat Res. 2009 Mar-Jun; 681(2 - 3): 241 - 58.

7. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing // Environ Mol Mutagen. 2000; 35(3): 206 - 21.

8. Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека: MP 1.2.2522-09 . Москва, 2009.

9. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: МУ 1.2.2520-09 . Москва, 2009.

Новое на сайте

>

Самое популярное